ITEST ASO
Význam a použití
Souprava ITEST ASO je určena k titraci antistreptolysinu O (ASO) v sérech. ASO je protilátka proti streptolysinu O (SLO) - extracelulárnímu produktu streptokoků skupiny A (1). Prožití streptokokové infekce se tedy projeví vzestupem hladiny ASO. Tyto infekce jsou závažné zejména svými následky - akutní revmatickou horečkou a akutní glomerulonefritidou.
Stanovení titru ASO je proto nezbytným doplňkem diagnostiky těchto onemocnění. Titraci ASO lze poměrně dobře standardizovat a protilátky lze určovat kvantitativně (2).
Vzhledem k obrovské četnosti streptokokových infekcí lze též používat titrace ASO jako "screeningové" metody pro zjišťování nedostatečné reaktivity imunitního systému.
Souprava ITEST ASO umožňuje rychlé a jednoduché provedení testu, protože dodávaný SLO obsahuje předem stanovený počet mezinárodních jednotek (m.j.). Souprava obsahuje všechny reagencie potřebné k provedení testu, mimo králičích erytrocytů. Ty je možno objednat samostatně (kat. č. SO 306).
Princip testu
Principem testu je neutralizace SLO protilátkou (ASO) přítomnou v séru. Zbylý SLO se prokáže hemolýzou přidaných erytrocytů. Aby hemolýza proběhla, musí být SLO v redukovaném stavu.
Obsah soupravy
1. kat. č. SO 302 Streptolysin O
Purifikovaný filtrát kultury streptokoka sk. A produkujícího SLO v lyofilizované formě. Lahvička obsahuje počet m.j. deklarovaný na štítku.
2. kat. č. SO 303 Redukční činidlo
Redukční činidlo – dithionitan sodný. 20 mg v lahvičce.
3. kat. č. SO 304 Koncentrovaný pufrovaný fyziologický roztok s albuminem (PFR+A)
Lahvička obsahuje 8 ml koncentrovaného fyziologického roztoku s fosfátovým pufrem a hovězím albuminem. Roztok je konzervován 0,1% azidem sodným.
4. kat. č. 305 Antistreptolysin O Standard (Sérum o známém titru)
Purifikovaný lidský IgG testovaný na přítomnost HIV, HBsAg a HCV s negativním výsledkem. Lahvička obsahuje počet m.j. deklarovaný na štítku. Poznámka: Králičí erytrocyty v Alseverově roztoku (25% suspenze, 40 nebo 20 ml) jsou dodávány samostatně (k.č. SO 306 nebo SO 307).
Provedení testu
Národní referenční laboratoř pro streptokoky a enterokoky SZÚ v Praze doporučuje následující metodu (3):
1. Příprava pufrovaného fyziol. roztoku s albuminem (PFR+A)
Obsah lahvičky s koncentrovaným PFR+A (8 ml) nařeďte 112 ml destilované vody. Získáte 120 ml roztoku o pH + 6,5 (pH roztoku překontrolujte a v případě potřeby upravte). Takto připravený roztok uchovávejte při +4oC a spotřebujte do sedmi dnů.
2. Příprava suspenze králičích erytrocytů
Králičí erytrocyty promyjte 3x v PFR+A a centrifugujte 10 min. při 1000g. Po poslední centrifugaci připravte ze sedimentovaných erytrocytů 1% suspenzi v PFR+A.
3. Příprava redukovaného streptolysinu O (SLO)
Do lahviček se SLO a Redukčním činidlem dejte po 1 ml PFR+A (nejlépe injekční stříkačkou přes gumovou zátku, abyste zamezili ztrátám lyofilizovaného materiálu). Po dokonalém rozpuštění přeneste kvantitativně obsahy obou lahviček do ml PFR+A. Takto připravený roztok SLO obsahuje 1 m.j./0,5ml. Roztok spotřebujte tentýž den.
4. Ředění séra
Ve zkumavkách připravte dvě základní ředění vyšetřovaného,inaktivovaného (56oC po dobu 30 min.) séra:
a) 1:25 (50 m l séra + 1,2 ml PFR+A)
b) 1:30 (0,5 ml séra ředěného 1:25 + 0,1 ml PFR+A)
5. Příprava mikrotitrační destičky (typ U) a vlastní provedení testu
Sérum titrujte ve vodorovné řadě mikrotitrační destičky. U každého vyšetřovaného séra dejte do prvních dvou jamek po 50 ml PFR+A. Do zbylých 10 jamek dejte po 25 ml PFR+A.
Do první jamky přeneste 50 ml séra ředěného 1:25 a po důkladném promíchání přeneste pomocí mikropipety 50 ml do třetí jamky. Stejným způsobem pokračujte v ředění séra ve všech lichých jamkách až do jedenácté jamky. 50 ml naředěného séra z 11. jamky odstraňte.
Do druhé jamky přeneste 50 ml séra ředěného 1:30 a po důkladném promíchání přeneste pomocí mikropipety 50 ml do čtvrté jamky. Stejným způsobem pokračujte v ředění séra ve všech sudých jamkách až do dvanácté jamky. 50 ml séra z 12. jamky odstraňte.
K takto naředěnému séru přidejte do 1. a 2. jamky po 50 ml PFR+A a do všech ostatních jamek přidejte po 25 ml PFR+A a důkladně promíchejte (na třepačce nebo poklepem na stěny destičky). Z 1. a 2. jamky odstraňte po 50 ml naředěného séra. V každé jamce je potom konečný objem naředěného séra 50 ml.
Do každé jamky s naředěným sérem přidejte 25 ml redukovaného roztoku SLO. Po důkladném promíchání inkubujte ve vlhké komoře v termostatu 15 min. při 37˚C. Po inkubaci přidejte do všech jamek po 25 ml 1% suspenze králičích erytrocytů (před každým použitím suspenzi dobře promíchejte). Obsah jamek řádně promíchejte (poklepem na stěny destičky) a inkubujte 45 min. při 37˚C.
6. Odečítání výsledků
Odečtěte poslední jamku bez hemolýzy (matnou): reciproká hodnota příslušného ředěného séra udává titr ASO v m.j. Pro přehled uvádíme reciproké hodnoty ředění séra (tzn. titru ASO) v jednotlivých jamkách:
| Jamka č. | 1 | 2 | 3 | 4 | 5 | 6 | 7 | 8 | 9 | 10 | 11 | 12 |
| Hodnota m.j. | 100 | 120 | 150 | 180 | 225 | 270 | 337 | 405 | 506 | 607 | 759 | 911 |
7. Kontrola
7.1. Sérum o známém titru
Při titraci ASO v sérech je nutná současná titrace séra o známém titru, kterým je ASO standard dodaný v soupravě. Lyofilizovaný ASO standard rozpusťte v 1 ml PFR+A (= základní ředění 1:25).
Dále postupujte tak, jak je udáno v bodech 4.b až 6. Titr takto naředěného standardu je 405 m.j. (t.j. poslední jamka bez hemolýzy je č. 8). V rámci titrační chyby se může titr ASO standardu lišit o +1 jamku (poslední jamka bez hemolýzy může být č. 7 - 9).
Titraci ASO standardu proveďte pouze v 10 jamkách. 11. a 12. jamku použijte na kontrolu suspenze erytrocytů a kontrolu SLO.
7.2. Kontrola suspenze erytrocytů
Do 11. jamky (v řadě, kde titrujete ASO standard) dejte 75 ml PFR+A + 25 ml 1% suspenze králičích erytrocytů. Při odečítání výsledků nesmí dojít k hemolýze.
7.3. Kontrola SLO
Do 12. jamky (v řadě, kde titrujete ASO standard) dejte 50 ml PFR+A + 25 ml SLO + 25 ml suspenze králičích erytrocytů. Při odečítání výsledků musí dojít ke 100% hemolýze.
Hodnocení
"Normální" hodnoty ASO v séru jsou vysoce variabilní a závisí na věku vyšetřovaného, geografické oblasti, epidemiologické situaci, ročním období a pod. Za horní hranici "normálních" hodnot ASO bývá obvykle pokládán titr 200 m.j. (4). Daleko spolehlivější pro průkaz předchozí streptokokové infekce je zjištění signifikantního vzestupu titru ASO v séru pacienta. U doporučené metody je to rozdíl mezi titrací dvou vzorků sér větší než jedna jamka. Vzestup ASO po streptokokové infekci obvykle dosahuje maxima mezi 3. a 5. týdnem po jejím začátku. Proto se doporučuje titrace nejméně 2 vzorků sér, odebraných s určitým časovým odstupem.
Po streptokokových infekcích dojde k vzestupu titru ASO zhruba v 80% případů. K zachycení většího počtu streptokokových infekcí je nutná titrace některé další streptokokové protilátky, např. antideoxyribonukleázy B.
K nespecificky zvýšenému titru ASO může také dojít v přítomnosti lipidů a lipoproteinů v séru nebo v sérech kontaminovaných.
Literatura
1. Hostetler C.L., Sawyer K.P., Nachamkin I. (1988): Comparison of three methods for detection antibodies to streptolysin O and DNase B. J.Clin.Microbiol. 26, 1406.
2. Wannamaker L.W., Ayoub E.M. (1960): Antibody titres in acute rheumatic fever. Circulation 21, 598.
3. Bícová R. (1997): Stanovení protilátky proti streptolysinu O mikrometodou. Epidemiol.Microbiol.Imunol., 46, č. 4, 140-144.
4.Johnson D.R., Kaplan E.L. et al. (1996): Laboratory diagnosis of group A streptococcal infections. WHO, Geneva.
Upozornění
1. Souprava ITEST ASO je dodávána v balení po 2 x 25 testech a je určena pouze pro použití in vitro.
2. Soupravu uchovávejte v temnu při 2 – 8°C a spotřebujte do doby exspirace uvedené na štítku.
3. Při poškození primárního obalu IVD nepoužívejte a kontaktujte výrobce.
4. Nespotřebovaný IVD a prázdný obal likvidujte v souladu se zákonem o odpadech č. 185/2001 Sb.